ポリオウイルス非感受性Vero/SLAM（VeroΔPVR1/2+hSLAM）細胞の作出について

はじめに

臨床検体からの麻疹ウイルスの分離には, 麻疹ウイルス受容体であるヒトSLAMを発現させたVero/SLAM細胞が世界的に広く使用されている。一方, 世界保健機関（WHO）は世界ポリオ根絶計画（Global Polio Eradication Initiative）を推進するため, 「野生株ポリオウイルスの型特異的根絶および経口生ポリオワクチン使用の段階的停止後におけるポリオウイルス取り扱い施設関連リスクを最小化するためのWHO世界的行動計画（GAP Ⅲ）」を2014年に策定した^1）。GAP Ⅲでは研究施設におけるポリオウイルス（PV）のバイオリスクマネージメントについて言及している。PVはVero/SLAM細胞にて増殖が可能であり意図せずPVを増殖させる可能性があるため, バイオリスクマネージメント上問題となりうる。そこで本稿では, 麻疹ウイルス分離に使用可能なポリオウイルス受容体（PVR）欠失細胞株VeroΔPVR1/2+hSLAMの作出背景詳細と, 細胞の性状について記述する。

GAP Ⅲ対応VeroΔPVR1/2+hSLAM細胞作出の背景

PVは, 血清型により1型ポリオウイルス（PV1）, 2型ポリオウイルス（PV2）, 3型ポリオウイルス（PV3）の3種類に分類されている。積極的なポリオウイルス対策により, 2015年に野生株PV2, 2019年に野生株PV3の根絶が宣言された^2）。残る野生株PV1は, 一部地域（アフガニスタン, パキスタン）にてエンデミックな状態となっているが, 近い将来に根絶が達成されると考えられている。WHOは, ポリオ根絶計画の最終段階としてPVの取り扱い施設を限定し, GAP Ⅲに示されたバイオリスクマネージメントに従ったPVの取り扱いを施設に要求している^3）。PVはワクチン株を含めた糞便や咽頭ぬぐい液などの臨床検体, 汚水などの環境検体中に含まれている可能性があること, また麻疹・風疹サーベイランスに用いるVero/SLAM細胞^4）はPV感受性を持つこと, が明らかになっている。そのため, ポリオの流行がエンデミックな状態にある国・地域で採取した検体, あるいは過去に流行が発生した時期の保存検体から麻疹ウイルス（MeV）, または風疹ウイルス（RuV）の分離を実行する場合, 思いもよらずPVを分離・培養してしまう可能性を否定できない。そこで, PVを分離・培養することなくMeV, RuVを分離・培養できる細胞を作出することは, 麻疹・風疹サーベイランスだけでなく, GAP Ⅲの定めるPVバイオリスクマネージメントにも貢献すると考えられた。

VeroΔPVR1/2+hSLAM細胞の作出

麻疹ウイルスの研究に汎用されているVero/SLAM細胞は, PVレセプター（PVR）^5）を発現しているため, PVに対して高い感受性を持つ。PV非感受性Vero/SLAM細胞を作出するため, 我々はまずはじめに2種類のPVR遺伝子を欠損させたVero細胞（VeroΔPVR1/2）をCRISPR/Cas9システムを用いて作出した^6）。次いで, 野生株MeVに対する感受性を付与させるため, VeroΔPVR1/2にヒトMeVレセプター遺伝子（hSLAM）を導入してVeroΔPVR1/2+hSLAM細胞を作出した^7）。本細胞株は, 国立研究開発法人 医薬基盤研・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクより購入が可能である（細胞登録番号 JCRB1901）。

VeroΔPVR1/2+hSLAM細胞のPV, MeV, RuVに対する感受性の評価

VeroΔPVR1/2+hSLAM細胞にPVを混入させたMeV溶液, またはPVを混入させたRuV溶液を接種した時, それぞれMeV, RuVだけ分離できるかを検証した。各々のウイルス液をVeroΔPVR1/2+hSLAM細胞に接種し, 継時的に細胞懸濁液を回収した。各ウイルスの増殖は, 細胞懸濁液から抽出したウイルスRNA量をreal-time RT-PCR法で測定し評価した。

PV1を混ぜたMeV溶液をVeroΔPVR1/2+hSLAM細胞に感染させると, PV1（▲）は増殖せずMeV（●）のみが増殖した（図A）。一方, コントロールとして用いたVero/SLAM細胞では, 感染後1日目からPV1（◆）の急速な増殖が起こり, PV1感染による細胞死によりMeV（■）が増殖できないことが確認できた。また, PV1を混ぜたRuV溶液をVeroΔPVR1/2+hSLAM細胞に感染させた場合は（図B）, PV1（▲）の増殖なくRuV（●）のみが増殖することが確認できた。Vero/SLAM細胞では, MeVの場合と同様に, PV1（◆）の増殖による急速な細胞死が起こり, RuV（■）が増殖することはなかった。

また同様の結果がPV3を用いた試験でも得られている。PV2に関しては実験室での取り扱いが困難なことより試験は実施できなかった。以上PV1およびPV3の試験結果より, VeroΔPVR1/2+hSLAM細胞を用いると, PVの混入したMeV, RuV検体からMeV, RuVだけを選択的に分離できることが確認できた。

おわりに

ポリオ根絶が目前に迫りつつある現在, PV検体の取り扱いにはGAP Ⅲに従ったバイオリスクマネージメントが求められている。PVは, 臨床検体中に含まれる可能性を排除できないことから, 今後は麻疹・風疹サーベイランス検体の取り扱いにGAPⅢ 対応が求められる可能性が出てくる。これらを踏まえ, VeroΔPVR1/2+hSLAM細胞株を作出したことは, 麻疹・風疹を含めた臨床検体のサーベイランスに資すると考えられた。

参考文献