糞便からのザルコシスティス検出法の開発

馬肉生食によるザルコシスティス食中毒の検査は、現在馬肉（残品）を検体とする検査法が通知されている状況であり、馬肉内の同寄生虫を証明することがその目的となっている。一方、多くの他の病原体による食中毒事例をみても、残品が必ずしも検体として入手できるわけではなく、患者検体（便、吐物）からの病原体検出が必要となる場合が多い。本食中毒事例においても今後同様の対応が求められることを想定して、実験的に便検体からザルコシスティスを検出する方法を考案した。

方　法
ザルコシスティス食中毒事例とは無関係の下痢便試料に、通知法の遺伝子検査で使用するスタンダードDNAをスパイクし実験的に便を汚染し、DNA抽出精製、PCRによる遺伝子増幅を行った。

１．糞便検体へのDNA添加とDNA抽出
50mgの糞便を1.5mlエッペンドルフチューブに取り、TE溶液300μlを加え、ヴォルテックスでよく攪拌し、卓上遠心機で10秒間遠心分離した上清200μlをDNA抽出用試料とする。ここで通知法の遺伝子検査法で使用するスタンダードDNAを添加し10倍希釈系列を作製した。市販のQIAGEN-QIAamp DNA Mini Kitを用いて手順書に従いDNA抽出し、AEバッファー100μlに溶出した。

２．PCRによるSarcocystis  DNAの増幅
糞便中に含まれるSarcocystis  DNAは極微量であると想定されることから、本試験では感度を上げるためNested-PCRを適用した。

１）1st-PCR 
プライマーはザルコシスト暫定試験通知法に記載されている18SF1: 5'-GGATAACCGTGGTAATTCTATGならびに18SR11: 5'-TCCTATGTCTGGACCTGGTGAGを用いた。DNAポリメラーゼとしてTAKARAのEx Taq HotStart ver.を用い、上記テンプレートDNAは１μl加え反応液量は25μlとした。温度反応条件は、95℃・５分間の熱変性後、95℃・30秒間、56℃・30秒間、72℃・１分間を１サイクルとし、これを40サイクル繰り返した。

２）Nested（2nd）-PCR
プライマーはHRS1F:5'-GATACAGAACCAATAGGGACATCACならびにHRS3R: 5'-ACTACCGTCGAAAGCTGATAGGを用いた。本プライマーは馬肉より検出されるSarcocystis fayeri の18S rRNA遺伝子解析より設計されたもので、S. fayeri 特異的なDNA増幅（およそ140bp）を行うプライマーである。PCR反応液の調整は用いるプライマーを変更したのみで、必要な試薬類の量は1st-PCRの場合と同様である。テンプレートDNAには1st-PCRの産物を１μl用いた。温度反応条件は、95℃・５分間の熱変性後、95℃・10秒間、60℃・30秒間、72℃・10秒間を１サイクルとし、これを40サイクル繰り返した２％アガロース/TBEバッファーで産物を電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によりDNAバンドの確認を行った。

結果と考察
上記の方法から、1st-PCRでは10⁶コピー/200μlが検出限界であったが、nested-PCRでは10³コピー／200μlの条件でDNA増幅が確認できた（図１）。添加試験の感度として10³コピー／200μlが得られたが、これまでの研究よりブラディゾイト１個当たり10～20コピーの18S rDNAが存在すると算定されるので、50～100ブラディゾイト分のDNAが200μl中に存在した場合、それをDNAとして検出できることになる。実際の食中毒事例検体中の原虫量に関してはデータがない状態なので、検体入手が可能な事例において本試験法の実用性を検証していきたい。